توضیحی مختصر در مورد کاربرد روشهای مختلف تشخیص ژنتیکی در پزشکی

همکاران ارجمند

با سلام و ادای احترام. بدون شک ارائه مطلوب خدمات پزشکی از طریق همکاری علمی متخصصین رشته های مختلف علوم پزشکی امکان پذیر است. در این میان تشخیص و پیشگیری از بیماریهای ژنتیکی به لحاظ تنوع و گستردگی آنها از یک سو و نادر بودن اغلب آنها از پیچیدگی های خاصی برخوردار است. هزاران نوع بیماری ژنتیکی که کلیه بافتها و ارگانهای بدن انسان را درگیر می کنند تا کنون مورد شناسایی قرار گرفته اند که به روشهای سیتوژنتیکی، مولکولی، و سیتوژنتیک مولکولی (FISH و Microarray) مورد تشخیص قطعی آزمایشگاهی قرار می گیرند. امروزه با استفاده از روش غیر تهاجمی (Non-Invasive Prenatal Testing=NIPT) عدم ابتلاء جنین به اختلالات شایع کروموزومی با دقت ۹۹ درصد قابل دسترس است. طی سالهای اخیر با ورود روشهای (Next Generation Sequencing=NGS) که توانایی آنالیز گلوبال ژنوم انسان را دارا می باشند به تشخیص های آزمایشگاهی، امکان تشخیص نه تنها بیماری های تک ژنی بلکه بیماریهای هتروژن، چند ژنی و چند عاملی نیز فراهم شده است.

امروزه با توجه به کنترل شدن اغلب بیماریهای عفونی و بیماریهایی که در اثر سوء تغذیه به وجود می آیند، مشکل بیماریهای ژنتیکی به خصوص در نوزادان و کودکان بیش از پیش نمایان شده است. بیش از ۶۰ در صد مرگ و میر کودکان به دلیل ابتلاء به بیماریهای ژنتیکی اتفاق می افتد. اغلب بیماریهای ژنتیکی موجب معلولیت های شدید ذهنی-جسمی در افراد مبتلا می شوند و متآسفانه بسیاری از آنها غیر قابل درمان هستند. لذا تولد یک نوزاد مبتلا به این نوع بیماریها به معنی درگیری روحی روانی و عاطفی طولانی مدت خانواده می شود. به همین دلیل در مورد آنها پیشگیری تقریبآ همه اقدامی است که نظام بهداشتی و درمانی می تواند انجام دهد.

با این حال بهره گیری مطلوب از روشهای فوق برای تشخیص، پیشگیری و درمان بیماریهای ژنتیکی مستلزم اطلاع از کاربردها، محدودیت ها و نقاط قوت آنهاست.

۱- روشهای کاریوتایپینگ: برای تشخیص اختلالات کروموزومی در جنین ها، افراد مبتلا به عقب ماندگی ذهنی همراه با علائم دیسمورفیک، علل سیتوژنتیکی سقط مکرر، ناباروری، لوسمی ها و سایر انواع بدخیمی ها و ….. بکار می رود. با این حال قطعات کوچکتر از ۸ میلیون باز به این روش قابل تشخیص نیستند. طول بزرگترین ژن انسان یک میلیون و دویست هزار باز است. بنابراین حذف، اضافه شدن یا جابجا شدن چند ژن مجاور هم به این روش قابل تشخیص نخواهد بود.

۲- روش FISH: با این روش فقط می توان تعداد کپی یا جایگاه کروموزومی ناحیه ای از ژنوم را که پروب اختصاصی آن مورد استفاده قرار گرفته است شناسایی کرد. به عنوان مثال اگر پروب نشاندار شده اختصاصی ۲۱q22 (بخشی از کروموزوم ۲۱ که در بروز علائم سندروم داون تآثیر دارد) مورد استفاده قرار گیرد، تعداد کپی و محل استقرار فقط همان ناحیه را می توان در ژنوم مشخص کرد (Target based). از این روش هم برای تشخیص اختلالات تعدادی و هم اختللالات ساختمانی کروموزومها نظیر حذف، اضافه شدن، جابجایی قطعات کروموزومی و نیز تشخیص حالت موزائیک اختلالات کروموزومی استفاده کرد. این روش کاربرد بسیار کارآمدی در تشخیص پیش از تولد انواع سندرومهای کروموزومی و نیز پروتکل درمانی انواع سرطانها (Personalized medicine) دارد. با این روش تغییرات مربوط به قطعاتی از کروموزوم که طولشان ۱۰۰ هزار باز یا بیشتر است را می توان زیر میکروسکپ فلورسانس مشاهده کرد. یعنی حداقل ۸۰ برابر بیشتر از حساسیت روشهای کاریوتایپینگ.

۳- روش CGH-Microarray: صرفآ توانایی تشخیص حذف یا اضافه شدن قطعاتی از ژنوم به طول ۱۰۰ هزار باز با دقت ۸۰% و ۲۰۰ هزار باز با دقت ۹۰% را دارد ولی نمی تواند جابجایی قطعات کروموزومی را شناسایی کند. در عین حال با این روش امکان تشخیص گوناگونی طبیعی از موارد بیماریزا در “تعداد تکرار قطعات کروموزومی” وجود ندارد. به همین دلیل تآیید نتایج حاصل از این روش به وسیله تکنیک FISH برای مشخص کردن پاتوژن بودن یا نبودن تغییرات گزارش شده ضروری است.

۴- روش MLPA: همانند روش Microarray با این روش فقط می توان حذف یا اضافه شدن قطعات ژنوم را تشخیص داد و امکان تشخیص اختلالات متعادل کروموزومی مثل جابجایی یا واژگونی با این روش مقدور نیست. در این روش نیز گوناگونی طبیعی از موارد بیماریزا در “تعداد تکرار قطعات کروموزومی” قابل شناسایی نیست و این روش نیز همانند روش FISH به صورت Target based عمل می نماید. حساسیت این روش نیز در حد روش FISH می باشد.

۵- روشهای مولکولی مبتنی بر PCR : برای تشخیص پاتولوژی مولکولی بیماریهای تک ژنی که توالی نوکلئوتیدی ژن مسئول آنها کاملآ شناخته شده است به کار می رود. بنابراین بیماریهایی که ساختار ژن مسئول آنها ناشناخته است، قابل بررسی نیستند. همچنین این روشها در تشخیص بیماریهایی که ژن مسئول آنها بسیار بزرگ است (مثل ژن دیستروفین)، بیماریهای هتروژن (بیماریهایی که ژنهای مختلفی در پیدایش آنها نقش دارند مثل بیماری Retinitis Pigmentosa=RP) یا بیمارهای چند ژنی (بیماریهای که چند ژن مشترکآ در بروز آنها نقش دارند) کارآیی لازم را ندارند. بنابراین در موقع معرفی بیمار متخصص محترم باید به نوع بیماری فرد ارجاع داده شده اشاره نماید (مثلآ تشخیص مولکولی بیماری (CF).

۶- روش NIPT: روش غربالگری جدیدی است که برای بررسی احتمال سالم بودن یا ابتلاء جنین به ناهنجاریهای شایع کروموزومی (۱۳،۱۸،۲۱،۱۶، x وY) و همچنین برخی ریز حذف ها مورد استفاده قرار می گیرد. این روش نیز مانند روشهای قبلی غربالگری، غیر تهاجمی است و از طریق بررسی نمونه خون مادر در هفته ۱۰ یا ۱۳ بارداری انجام می گیرد. دقت این روش در مقایسه با روشهای قبلی خیلی بیشتر است (۹۹%) و احتمال جواب کاذب مثبت در آن ۱% است.

با این حال NIPT یک روش تشخیصی نیست، به این معنی که نمی تواند اطمینان قطعی از سلامت جنین را ارائه دهد و به همین دلیل صحت نتایج آن به اندازه روشهای تهاجمی مثل کشت آمنیوسیت یا CVS نیست و در صورت پر خطر بودن جواب، نیاز به استفاده از روشهای تهاجمی تشخیصی وجود دارد. هزینه این آزمایش در مقایسه با روشهای قبلی غربالگری بیشتر است.

۷- نسل جدید توالی یابی (NGS): مهمترین روشهای نسل جدید توالی یابی شامل: whole-genome sequencing (WGS), whole-exome sequencing (WES), Targeted exome sequencing (TES) E و “(hotspot” sequencing (HSS می باشد.

• WGS: کل ژنوم (شامل DNA کروموزومی اعم از اگزون و اینترون و DNA میتوکندریایی) یک نمونه را تعیین توالی می کند. مهمترین نقطه قوت این روش توانایی آن در تشخیص اختلالات کل ژنوم، شامل جایگزینی نوکلئوتیدی، حذف، اضافه، مضاعف شدگی، تغییر در تعداد تکرارهای یک ژن یا اگزون، واژگونی جابجایی قطعات کروموزومی با مقادیر کمتری از DNA و در زمانی کوتاه تر در مقایسه با روش معمولی تعیین توالی است. اگرچه با روش NGS کل ژنوم و توالی کل DNA فرد بررسی می شود ولی فقط ۳% از ژنوم در تشخیص بالینی مورد استفاده قرار می گیرد. به همین دلیل این روش در پروژه های تحقیقاتی بیشتر کاربرد دارد تا تشخیص های بالینی.

• WES: روشی است که در ان تمامی نواحی کد کننده پروتئین در ژنوم (کلیه اگزونهای ژنوم) را تعیین توالی می کند.

• TES: ژن یا ژنهای مرتبط با بیماری یا بیماریهای خاص ابتدا غنی سازی و سپس تعیین توالی می شوند. کاربرد این روش در قالب پانل های مختلف برای بررسی موتاسیون های ژنهای مرتبط با بیماریهای ژنتیکی و سرطانها بطور چشم گیری در حال افزایش است. این روش همچنین با عمق بیشتری انجام می گیرد که موجب افزایش چشمگیر دقت توالی یابی می شود.

• HSS: بجای تعیین کل توالی یک ژن فقط نواحی از یک ژن که محل وقوع موتاسیونهای متعدد و مکرر است تعیین توالی می شود. اگرچه در این روش امکان بررسی حجم وسیعی از نمونه های DNA فراهم می شود ولی به دلیل اینکه همه نواحی یک ژن مورد بررسی قرار نمی گیرد احتمال عدم تشخیص برخی از موتاسیون ها که در خارج از Hot spot هستند وجود دارد.

یکی از محدودیت های مهم روشهای NGS که کاربرد آن را در تشخیص علل ژنتیکی برخی از بیماریها با تردید مواجه می کند عدم امکان تشخیص گوناگونی های نرمال از تغییرات پاتوژن است. همچنین تفسیر اهمیت بالینی بعضی از موارد غیر طبیعی شناسایی شده در این روش، با توجه به عدم وجود یافته های علمی کافی میسر نیست.